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　　几乎一出现超分辨率显微镜，科学家们就将它们指向称为驱动蛋白的分子马达。这些由分子燃料 ATP 提供动力的蛋白质通过沿着称为微管的蛋白质高速公路穿梭运输货物，驱动包括细胞分裂、细胞信号传导和细胞内运输在内的关键过程。长期以来，研究人员一直想了解这些电机的工作原理，但为了将它们可视化，科学家们不得不将它们放慢速度或将它们隔离在简化的体外 系统中。

　　现在，在同时发表在《科学》杂志上的论文中，两个独立工作的团队使用一种名为 MINFLUX 的超分辨率工具在生理相关的 ATP 浓度下近实时地研究电机。第一篇论文由 MINFLUX 的发明者 Stefan Hell 领导，他在德国哥廷根的马克斯普朗克多学科科学研究所 (MPI) 和海德堡的 MPI 医学研究联合任命，使用新的仪器设计来跟踪3D 中的蛋白质，揭示了有关其运动的细节1。第二个项目由海德堡欧洲分子生物学实验室的生物物理学家 Jonas Ries 领导，首次证明 MINFLUX 即使在繁忙的活细胞中也能追踪驱动蛋白2。

　　“这项技术需要很多不同的东西才能发挥作用，看到所有这些东西结合在一起很有趣，”加州大学欧文分校的生物医学工程师 Michelle Digman 说，她开发了成像策略，但并未参与其中任何一项学习。“这似乎是一个概念证明，表明他们能够非常精确地追踪驱动蛋白。当你拥有活细胞系统时，那就更加壮观了。”

　　走路走路

　　在 1985 年发现驱动蛋白后不久，研究人员就开始研究驱动蛋白运动的基础知识，但超分辨率工具的出现带来了新的细节水平。2004 年，研究人员使用一种称为 FIONA（精度为一纳米的荧光成像）的技术来证明驱动蛋白，它看起来像一个穿着超大号鞋子的高大扭曲的茎，在其微管轨道上“手拉手”行走，移动它的当他们穿过一组单杠时，脚的动作类似于儿童的手3。但是，尽管 FIONA 提供了出色的空间分辨率，科学家们不得不定量 ATP 以减慢蛋白质的速度以对其进行研究。在过去十年中，研究人员用锗4或金5珠标记驱动蛋白跟踪它，但这些相对笨重的标签让人怀疑这些方法能否很好地概括蛋白质的整个运动范围。

　　当 Hell 和他的团队在 2016 年推出6 MINFLUX 时，他认为这是比其前身受激发射耗尽 (STED) 显微镜的进步，Hell 也因此获得了 2014 年诺贝尔化学奖。STED 使用叠加在激发激光上的环形“耗尽”激光，有效地将荧光区域缩小到传统的光衍射极限（约 250 纳米）以下。相比之下，MINFLUX 使用环形激光在其中心创建一个零荧光强度点。通过移动这种激光，研究人员可以以接近生理的速度精确定位荧光分子的位置。

　　在 3 月发表的新研究1中，Hell 的小组测试了 MINFLUX 的一个版本，该版本在焦平面的两个方向上快速连续脉冲线性激光，通过找到重叠荧光强度最低的位置来定位蛋白质。通过结合多项测量，研究人员能够生成显示分子沿微管移动位置的轨迹，就像绘制跑步者路径的应用程序一样。

　　Hell 说，虽然新的 MINFLUX 并不比之前的迭代更有效，但他的团队能够用它推断出驱动蛋白的步行速度为每秒 550 纳米，步幅为 16 纳米，ATP 浓度与那些相似在活细胞中发现。通过标记和跟踪蛋白质的不同部分，该团队还表明，每个步幅都包含两个 8 纳米的子步，并且驱动蛋白的柄在移动时会旋转，从而导致向前运动并略微向右旋转。作者还发现，当只有一只脚与微管结合时，ATP 会被吸收，但当双脚都被结合时，ATP 就会被消耗——解决了之前相互矛盾的发现7、8。

　　Ries 和他的团队从不同的角度研究了驱动蛋白的运动。他们使用由 Hell 与人共同创立的位于哥廷根的公司 Abberior 开发的商业 MINFLUX 仪器来追踪活细胞中的蛋白质。拥挤和不断变化的细胞环境意味着该小组最终得到的轨道更少，但他们能够捕捉到从一个微管到另一个微管的侧步、停滞和跳跃——所有这些都是蛋白质为绕过通常不会遇到的路障所做的努力见于纯化样品。“否则，我们看到的东西非常相似：相似的步行速度，相同的步幅，”Ries 说。“能够首次在活细胞中测量这些，真是太好了。”

　　宾夕法尼亚州立大学生物医学工程师 William Hancock 研究驱动蛋白，但并未参与这两项研究，他称这些研究“相当不可思议”。他指出，这些结果在很大程度上与过去的工作密切相关，几乎所有这些工作都是在 体外使用纯化的马达蛋白完成的。“我们在那里得到了非常具体的答案，但能够推断回细胞内部真是太好了。这真是一场杰作。”

　　向前行驶

　　也就是说，很明显 MINFLUX“尚未达到其性能的极限”。他说，在实现亚纳米空间分辨率后，MINFLUX 仍有待改进的一个领域是时间性能。两组都使用高达 1 毫摩尔的 ATP 浓度，但平均细胞含有的 ATP 浓度是原来的四倍多。

　　弗吉尼亚州阿什本霍华德休斯医学研究所 Janelia 研究园区的有机化学家 Luke Lavis 说，在这些条件下实现实时时间分辨率将需要更好的跟踪系统，他开发了 Ries 研究中使用的染料。“如果我可以这么说的话，超分辨率成像的这场革命让人们关注到一个事实，即我们使用的许多标签和附件策略都很大，”他说。“我们所有人的梦想是能够将小分子荧光团连接到蛋白质上的特定位置，而连接基团只是几个原子。” 他补充说，遗传密码扩展等新工具正在朝这个方向发展，其中合成氨基酸被设计成蛋白质以促进标记，但“它们远非交钥匙”。

　　这些进展可以开辟多种研究途径，特别是如果它们允许研究人员同时追踪多种蛋白质或蛋白质中的多个位点。今年，研究人员推出了一种名为 RESI（通过连续成像提高分辨率）的工具，旨在实现这一目标9。RESI 可以用不同的标签标记同一目标分子的相邻副本，使科学家能够区分相距小于一纳米的分子。尽管 RESI 目前仅适用于固定或静止的分子，但将其发现与 MINFLUX 跟踪非固定拷贝的数据相结合可能会产生关于蛋白质排列和运动的补充发现。

　　Ries 对研究其他运动蛋白很感兴趣，并且在他的论文2中分享的补充实验中，将 MINFLUX 应用于肌肉收缩蛋白肌球蛋白。2019 年，拉维斯与他人共同创立了一家公司，将单分子追踪用于药物开发。其他科学家建议从转录因子和 DNA 结合蛋白到粘连蛋白和其他分子马达的一切作为未来研究的目标。

　　但加州大学洛杉矶分校加州纳米系统研究所的生物医学工程师兼项目科学家 Haley Marks 表示，MINFLUX 成为真正易于使用且价格合理的“即插即用”系统还需要时间。与此同时，她建议，MINFLUX 可以通过为虚拟超分辨率工具做出贡献来使更广泛的社区受益。这些人工智能算法对大量显微镜图像进行训练，以学习如何从传统显微镜图像中创建超分辨率图像。Marks 说，由此产生的数据“对于买不起数百万美元显微镜的人来说更容易获得”。

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